欢迎访问山东业创实验设备有限公司网站!公司以讲诚信、重质量的经营宗旨,以先进的技术,优质的服务为用户提供准确、可靠、耐用的优质产品。

「山东业创实验设备」

专家团队 质量保证 售后服务 解决方案服务商

业创愿与您共同创建世界高端实验室

全国免费咨询热线18905301689

如何成功完成你的聚合酶链反应实验

文章出处:www.sdyechuang.cn 人气:发表时间:2019-12-27 19:46

【导读】聚合酶链反应是一种体外核酸扩增系统。其原理类似于脱氧核糖核酸分子的自然复制过程。待扩增的脱氧核糖核酸片段及其两侧互补的两个寡核苷酸引物变性、退火并延伸几个循环,然后将脱氧核糖核酸扩增2n次。这项技术已经成为分子生物学中帮助克隆脱氧核糖核酸和基因分析的必要工具。

聚合酶链式反应(多聚酶链式反应)是一种体外核酸扩增系统。其原理类似于脱氧核糖核酸分子的自然复制过程。在待扩增的脱氧核糖核酸片段和与脱氧核糖核酸片段两侧互补的两个寡核苷酸引物变性、退火和延伸后,脱氧核糖核酸被扩增2n倍。该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。

首先,你必须搞定PCR引物的设计

要先对PCR目的序列长度要有大致估计:

*步:找到Primer3站点

第二步:贴上模板序列。,你不需要记住这个网站,但是你需要记住单词“Primer3”,然后打开GOOGLE主页并输入Primer3。跳出的*项是“引物3输入0.4.0(引物3-网络/HTDOCS/输入-040.htm)”,http://frodo.wi.mit.edu

第三步:重要参数设定。进入引物3站点,您可以看到引物设计界面。(附件:Word文档中有一张图片)将您的模板序列粘贴到“将源序列粘贴到下面(5'-3 ' .)的大空框中。请注意,它是在5'-3 '的方向。数字或空格并不重要。软件会自动过滤。

第四步:Pick primers首先是“产品尺寸范围”。如果你不想让软件为你做任何事情,首先要调整的就是这个参数。默认参数实际上是从100到1000,您必须自己更改。如果你想让产品的尺寸满足你的期望,根据具体情况,将范围尽可能小,例如480到500。第二个参数是“底漆尺寸”。默认值可以正常使用。然而,当你熟悉软件时,你会知道如何改变它。第三个参数是“素数”(PrimerTm),类似于素数。

第五步:引物设计检验::点击此按钮,符合您尺寸要求的底漆就出来了。看看Primer3输出的界面,多漂亮啊!您想要的引物已经出来了,序列上有引物的位置比较图,以及引物自身的信息,包括:位置、长度、Tm、气相色谱含量、任意位置的互补碱基数、3’端的互补碱基数和引物序列(注:下游引物为5’-3’),取决于产品大小、两个引物之间的任意互补碱基数、两个引物之间的3’端互补碱基数等。如果引物仍在参数设定的范围内,但不是祖伊加,将给出警告。

PCR实用技巧只能设计一个引物,只需在“选择左引物”或“选择右引物”前面勾选一个即可。您也可以定义自己的引物并将其放入引物框中(注意:下游引物的反向书写方向仍然是5’-3’)。如果满足设定条件,软件将对引物评分并给出警告信息。根据警告信息,您可以对自定义引物进行一些调整。当你做实验时,警告信息也会给你一些提示。醉应检查文献中发表的引物,以免被有意或无意误导。对于逆转录聚合酶链反应中使用的引物,zui允许产物穿过内含子,从而避免了对逆转录聚合酶链反应的潜在核酸干扰。在实际制作引物时,应去除内含子,仅外显子序列应放入源序列框中,上游和下游引物应通过定制引物设计分别全部或部分落在不同的外显子上。

#

1.primers design

#

注意:

设定

这是最重要的一步。理想情况下,仅退火至靶序列两侧的单个序列而不退火至其他序列的引物应满足以下条件:

1)足够长,18-24 bp,以确保特异性,当然,并不是说引物越长越好,引物越长,降低特异性和降低产量相同;

2)气相色谱法,40% ~ 60%;

3)5’末端和中间序列需要更多的气相色谱来增加稳定性;

4)在3’端避免GCrich。嘴后的3个碱基不需要气相色谱,或者嘴后的3个碱基不需要气相色谱(有人说:气相色谱/重心/重心/重心/重心更适合3’端嘴)。);

5)避免3’端互补,否则为二聚体;很容易引起;

6)避免3’处的不匹配;

7)避免二级结构内部形成;

9)使用合并引物时,参考密码子使用表,Tm生物偏好,不要在3’端使用合并引物,使用较高的引物浓度(1微米-3微米);

10)zui已经学会使用设计软件,PP5,Oligo6,脱氧核糖核酸之星,向量NTI,在线设计等

*引物的另一个重要参数是熔化温度(Tm)。这是当50%的引物和互补序列表达为双链脱氧核糖核酸分子时的温度。Tm对于设置聚合酶链反应退火温度是必要的。在理想状态下,退火温度足够低,以确保引物与目标序列的有效退火。同时,它应该足够高以减少非特异性结合。合理的退火温度为55℃-70℃。退火温度通常设定为5℃。低于底漆的Tm。

有几种公式。适用于:为获得zui佳结果,两个primer应具有近似的Tm值。具有大量来自高盐溶液杂交的引物, 少于18个碱基。

根据气相色谱含量估算Tm。确定primerTmzui可信度的方法是邻居分析方法。该方法从序列水平结构和相邻碱基特征预测引物的杂交稳定性。大多数计算器程序使用相邻的分析方法。

Tm因所用的配方和引物序列而异。因为大多数公式提供了估计的Tm值,所以所有退火温度只是一个起点。通过分析几个逐渐升高退火温度的反应可以提高特异性。首先,它低于估算的Tm5℃,退火温度以2℃的增量逐渐升高。较高的退火温度将减少引物二聚体和非特异性产物的形成。如果

stability of primers引物对的Tm差异超过5℃,引物将在循环中使用较低的退火温度,并显示明显的错误启动。如果两种引物Tm不同,退火温度设定为5℃。c .低于Tm低于zui,或者,为了提高特异性,根据较高Tm设计的退火温度可以首先经历5个循环,然后剩余的循环可以在根据较低Tm设计的退火温度下进行。从而可以在更严格的条件下获得目标模板的部分拷贝。

:定制

primer标准纯度对于大多数PCR应足够。PCR操作时应注意事项1

引物产率受合成化学效率和纯化方法的影响。定制底漆以干粉形式运输。zui擅长用TE对底漆进行再溶解,使其最终Zui浓度达到100 μ m,TE优于去离子水,因为水的酸碱度往往微酸性,导致低核素水解。底漆的稳定性取决于储存条件。干粉和溶解底漆应储存在-20℃。溶解在浓度大于10μM的TE中的引物可在-20℃下稳定储存6个月,但在室温(15℃-30℃)下可储存不到1周。干粉底漆可在-20℃下储存至少1年,醉可在室温(15℃-30℃)下储存2个月以上。

 

)划分操作区:

增加PCR特异性:

目前,普通PCR尚不能做到单人单管,实现完全闭管操作,但无论是否能够达到单人单管,均要求实验操作在三个不同的区域内进行,

PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行:包括:包括:各工作区要具有一定隔离,操作器材专用,要有一定方向性,如,标本制备→PCR (1)标本处理区,扩增扩增板制备; (2)聚合酶链反应扩增区,反应液的制备和聚合酶链反应扩增; (3)产品分析区域、凝胶电泳分析、产品拍照和重组克隆制备。产物分析产物处理。切记:产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。2)分装试剂:PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫

外灯的或负压工作台配制和分装,所有的加样器和需固定放于其中,

不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源超净010-1000 (1)①聚合酶链反应水应为高压双蒸水; (2)用高压双蒸水在无扩增产物区制备引物和d-NTP; (3)底漆和d-NTP应分开存放,重新包装时应标明时间,以便发现污染原因;因此,我们不仅要小心进行扩增反应,还要注意样品收集、提取和扩增的所有环节: (1)戴一次性手套,如果意外溅出反应液,立即更换手套; (2)使用一次性吸头。严禁在分析室将吸头与聚合酶链反应产物混合。吸头不应长时间暴露在空气中,以免气溶胶污染。 (3)避免反应液飞溅。为了避免打开反应管时出现这种情况,在打开盖子之前,稍微离心收集管底部的液体。如果不小心洒在手套或桌面上,立即更换手套并用稀酸擦拭桌面; (4)在操作多个样品时,制备反应混合物,首先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,可以减少操作,避免污染,提高反应程度; (5)在醉后加入反应模板,加入醉后将反应管盖紧;

DNA

尽管扩增序列的大部分残留污染是假阳性反应的原因,但样品之间的交叉污染也是原因之一。

⑥建立操作过程中的阴阳对照和空白对照,可以验证聚合酶链反应的可靠性,有助于判断扩增系统的可信度。 ⑦尽可能使用可更换或高压进样器。由于进样器嘴容易被产品气溶胶或样品脱氧核糖核酸污染,嘴最好使用可更换或高压进样器。例如,如果没有这种特殊的样品进料器,至少样品进料器在聚合酶链反应操作期间应该是专用的,不能交叉使用,特别是用于聚合酶链反应产品分析的样品进料器不能到达另外两个区域; ⑧重复实验,验证结果,谨慎得出结论。研究结果表明,影响聚合酶链反应扩增效率的因素包括模板的复杂性和完整性、引物的纯度及其与模板的结合效率、反应温度、脱氧核糖核酸聚合酶的热稳定性和扩增性能、反应缓冲液()的离子组成、反应优化剂,都决定了聚合酶链反应实验检测的灵敏度。在zui最佳扩增条件下,常规聚合酶链反应可产生检测至pg (10-12g)数量级的靶基因。对于特定的靶基因,模板和引物通常是确定的因素。因此,聚合酶(3)实验操作注意事项:PCR扩增重要标准聚合酶灵敏度指的是的选择是研究者提高聚合酶链反应实验灵敏度的关键因素。 与实验室自匹配聚合酶链反应扩增系统相比,东升Taq Mix优化了反应缓冲液中的组分,添加了适当比例的反应增强剂,提高了脱氧核糖核酸聚合酶的热稳定性,显著影响了降低模板次级结构的聚合酶链反应扩增性能,使脱氧核糖核酸聚合酶处于zui自适应活性状态,从而获得了比自匹配系统更高的检测灵敏度。在即时反应系统中目标基因只有几个拷贝,而且很容易检测。

PCR

扩增反应能够检测到目的基因zui小值。主要指:阳离子(包括:DNA与反应缓冲液等)什么是PCR在聚合酶链反应实验本身灵敏度高和实验条件优化不足的情况下,靶片段通常伴随有其他杂带,即非特异性扩增。模板、引物性质和质量以及反应条件控制都影响聚合酶链反应扩增特异性。近年来,研究结果表明,缓冲液质量(实验特异性?)在确保聚合酶链反应特异性扩增中起着重要作用。一般来说,调节缓冲液中氢键的唯一盐是KCl,而东升HSTMTaq Mix的缓冲系统通过反应优化器和KCl/(NH4)SO4离子系统的平衡调节,显著提高了聚合酶链反应扩增的特异性,背景为降低。

聚合酶链反应实验的灵敏度和特异性是一对一和一对一的特征,这也决定了我们实验系统的调整实际上需要找到一个适合实验灵敏度和特异性的平衡点。由于聚合酶链反应系统成分众多,组合多,筛选工作复杂。东升分别基于灵敏度和特异性设计了聚合酶链反应混合物(PCR Mix)和HSTaq Mix,帮助您确定一个大的平衡点。如果您需要更详细的平衡点,请选择相应的混音套件系列进行微调。